細胞名稱：人結直腸癌氟尿嘧啶耐藥株細胞（STR鑒定）

細胞代碼：HCT15/Fu

培養(yǎng)條件：1640+10%FBS+1%P/S +20ug/ml 5-FU

生長狀態(tài)：貼壁生長

耐藥細胞構建方法

 目前已知的體外建立耐藥細胞株的方法主要有以下幾種：大劑量藥物沖擊法、藥物濃度遞增法、藥物濃度遞增與大劑量藥物沖擊相結合法、轉基因結合藥物篩選法。其中藥物濃度遞增法和大劑量藥物沖擊法成為臨床建立腫瘤細胞耐藥模型的常用方法。

①藥物濃度遞增法是指最初使用低濃度的藥物刺激細胞，等待細胞適應低濃度的環(huán)境之后，再略微提高藥物濃度，繼續(xù)等待細胞適應目前的環(huán)境，經過反復的培養(yǎng)和加壓，最終使細胞可以在高濃度的藥物環(huán)境下生存。

②大劑量藥物沖擊法是在細胞培養(yǎng)時加入超高藥物濃度的藥物，但是孵育的時間很短，一般僅有幾分鐘，然后將細胞轉移至不含藥物的培養(yǎng)液中慢慢恢復，通過重復以上步驟最終篩選出高倍數(shù)的耐藥細胞株。

這兩種方法各有優(yōu)缺點：藥物濃度遞增法的優(yōu)點在于誘導耐藥細胞的藥物劑量循序漸進，細胞培養(yǎng)的外環(huán)境逐漸改變，細胞較易耐受, 狀態(tài)較好, 缺點在于誘導耐藥過程耗時很長，且其化藥物的作用方式與臨床上療藥物大劑量短療程的療原則存在一定的差異；大劑量藥物沖擊法的誘導的優(yōu)點是與臨床上大劑量藥物沖擊的治療方式相接近，但是缺點在于大劑量藥物沖擊法的藥物濃度很高，細胞培養(yǎng)由于外環(huán)境驟變，細胞可能難以耐受，細胞狀態(tài)較難控制，且耐藥性能不穩(wěn)定。

建立模型的評價方法

建立模型的評價方法主要有以下兩種：耐藥倍數(shù)的檢測；耐藥相關蛋白的檢測。①通過MTT、CellTiter-Glo發(fā)光法（CTG）測定藥物對親本細胞和耐藥細胞的IC50，計算耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)（Resistance index，RI）=耐藥細胞系IC50/親本細胞系IC50。②WB、PCR、流式、免疫學等多項方法檢測耐藥相關蛋白（P-糖蛋白、多藥耐藥蛋白1）的表達情況。

人結直腸癌氟尿嘧啶耐藥株細胞（STR鑒定）

人肝竇內皮細胞永生化

人腸癌細胞永生化

人頸靜脈球瘤細胞永生化

人副神經節(jié)瘤細胞永生化

人腸息肉上皮細胞永生化

人原代聽神經瘤細胞永生化

人原代髓核細胞永生化

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雞胚成纖維細胞永生化

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37.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細胞的方法，此技術破壞性最小，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰消化細胞。

38.胰消化一個T25瓶的sf9細胞：

1. 去除培養(yǎng)基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5. 向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

40.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

42. 細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

43. 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

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