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COLO320-GFP-puro(GHRLOS過表達(dá))細(xì)胞

支原體污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的“頭號敵人”，但是支原體的存在卻十分普遍，它的“不請自來”總是讓我們措手不及。世界上有近60%的實(shí)驗(yàn)室正在遭受支原體污染的困擾，今天就讓我們來好好認(rèn)識這個“刺頭”吧！

什么是支原體？

支原體結(jié)構(gòu)簡單，具有高度多形性、無細(xì)胞壁、增殖緩慢、可在人工培養(yǎng)基中存活并增殖的特點(diǎn)。除此之外，它的“個頭”很小，只有0.1-0.3um，可通過一般的濾菌器。支原體主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成絲狀后斷裂呈球桿狀顆粒。大部分支原體繁殖速度比細(xì)菌慢，適宜生長溫度為35℃，最適pH值為7.8～8.0。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，形成典型的“荷包蛋”狀菌落。

支原體是如何欺負(fù)細(xì)胞的？

我們知道一株被支原體污染的細(xì)胞是無法用來做實(shí)驗(yàn)得出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的--一方面是因?yàn)橹гw本身也是一種原核細(xì)胞生物，相當(dāng)于一種交叉污染；另一方面，細(xì)胞感染支原體后，由于支原體大量消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)和細(xì)胞代謝的基礎(chǔ)成分，包括核酸前體、氨基酸、維生素、脂質(zhì)、膽固醇等，導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢及各種代謝、功能紊亂甚至喪失；除此之外，支原體還會吸附在細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞膜的完整性，更有少數(shù)類型支原體可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，如發(fā)酵支原體、生殖支原體和肺炎支原體。

如何確診細(xì)胞支原體污染？

支原體污染之所以讓廣大科研人員頭疼，是因?yàn)樗谄胀ü鈱W(xué)顯微鏡下難以被發(fā)現(xiàn)，并且細(xì)胞被污染早期不會表現(xiàn)出明顯的“癥狀”。

一般來說，如果培養(yǎng)過程中細(xì)胞增殖突然變慢，培養(yǎng)基中黑點(diǎn)、碎片明顯增多，培養(yǎng)基PH變化（變黃）周期變短，那么細(xì)胞很可能已經(jīng)感染了支原體。這時候，就需要使用各種檢測手段來確認(rèn)。目前常用的方法有：DNA染色法，支原體培養(yǎng)法，PCR法（包括凝膠電泳和熒光定量），化學(xué)發(fā)光法。前兩種方法結(jié)果可靠，但實(shí)驗(yàn)周期長。PCR法原理是在支原體16S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過檢測支原體DNA來檢測細(xì)胞中有無支原體的污染，得到的廣泛應(yīng)用。

細(xì)胞確診支原體污染后，怎么辦？

如果您的細(xì)胞不幸感染了支原體，好的處理方式是立即丟棄該細(xì)胞，并對培養(yǎng)箱、超凈臺等設(shè)施及場所進(jìn)行消毒滅菌。因?yàn)橹гw的傳播非常隱秘，相關(guān)研究表明其甚至能通過氣溶膠傳播。當(dāng)然，如果您的細(xì)胞非常珍貴或者不能再獲得，可以嘗試使用抑制支原體的藥物進(jìn)行處理，嘗試消除支原體污染。能抑制支原體的藥物有四環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類藥物，如羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素等；喹諾酮類藥物，如氧氟沙星、司帕沙星等。

這個過程一般周期較長，因?yàn)槭褂盟幬锾幚頃r需配合多次大比例連續(xù)傳代來提高成功率。堅(jiān)持，就是勝利！

傳代培養(yǎng)及其操作步驟

原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株)，可以進(jìn)行細(xì)胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細(xì)胞和分化特征。傳代細(xì)胞形成細(xì)胞株的最大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)材料，便于實(shí)驗(yàn)。

1、操作步驟：

（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。

（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細(xì)胞。

（6）用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

（7）細(xì)胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來確定。一般2～3d后應(yīng)換一次生長液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。

2、注意事項(xiàng)：

（1）掌握好細(xì)胞消化的時間，消化時間過短時，細(xì)胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。

（2）掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過高時，消化時間應(yīng)縮短，過低時細(xì)胞消化時間相對延長。

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