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免疫熒光單標(biāo)記和雙標(biāo)記的方法

1. 免疫熒光單標(biāo)記方法

免疫 熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

1)所需材料與試劑

(1)培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60％一70％的細(xì)胞。

(2)一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃預(yù)冷20min)。

(4)封閉液。

(5)0．01mol／LPBS緩沖液。

2)染色方法

(1)取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass―bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2―3遍

(2)加入0.3％的TritonX―100，37℃，30rain。

(3)加入4％多聚甲醛室溫固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

(4)正常阻斷血清1：20封閉室溫20～30min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃過夜。抗體以0.01mol／LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定)。

(6)0.3％TritonX―100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0.3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。

 (7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗，37℃，孵育1h。

(8)0.3％TritonX―100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用濾紙吸干。

 (9)90％甘油(PBS配制)封片。

(10)激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

 2．免疫熒光雙標(biāo)記方法

免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些，首先應(yīng)注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊，且盡量遠(yuǎn)離，通?？梢赃x擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。

3，樣品制備注意事項

(1)在進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記時，如樣品的來源為組織，應(yīng)采用冷凍切片。

(2)樣品制備應(yīng)滿足一般熒光顯微鏡觀察的要求

(3)盡量去除非特異性熒光信號。細(xì)胞經(jīng)熒光染色后可能會產(chǎn)生自發(fā)熒光，可用PBS取代一抗作為對照，以區(qū)分自發(fā)熒光和陽性結(jié)果。

 (4)為了不將細(xì)胞壓扁，蓋玻片與載玻片之間的介質(zhì)多用甘油與PBS混合液(9：1)封片，甘油還有抗熒光淬滅的作用。同時還應(yīng)注意封片時避免產(chǎn)生氣泡。

 (5)用指甲油將蓋玻片四周封片，注意避免將細(xì)胞壓扁。

 (6)為防止熒光淬滅，可在介質(zhì)中加入抗氧化劑DABCO(100mg／mi)，室溫，密封可保存6個月；或苯二胺(100mg／mi)，-20℃，保存2～3周。

蘇州千舍熱賣熒光標(biāo)記細(xì)胞：

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 人膽囊癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 GBC-SD+LUC

人永生化表皮細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HACAT+LUC

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HCC827+LUC

人結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HCT116+LUC

人宮頸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HELA+LUC  

人胃癌細(xì)胞黃色熒光標(biāo)記 HGC-27+YFP

人結(jié)直腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LOVO+LUC

人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MCF-7+luc

人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MDA-MB-231+LUC

人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MHCC-97H+luc

人胃癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 NCI-N87+LUC

人皮膚黑色素瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 SK-MEL-2+LUC

人卵巢癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 SK-OV-3+LUC

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人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 ZR-75-1+luc

小鼠乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 4T1+luc

小鼠黑色素瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 B16-F10+LUC

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 CT26+LUC

小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤熒光素酶標(biāo)記 GL-261+luc

小鼠肝癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HEPA1-6+LUC

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小鼠肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LLC+LUC

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MC38+LUC

   小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 neuro